實驗方法:

一、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，可采用低速離心。經離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據需要收獲目的細胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。其中，機械分散法的特點是簡便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差，適用于處理纖維成分少的軟組織。消化分離法是指把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學作用進一步使細胞間的橋連結構松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養后，細胞容易貼壁生長。

細胞簡介：

兔附睪上皮細胞分離自附睪組織；附睪（Epididymis）是一個由曲折、細小的管子構成的器官，一端接著輸精管（Ductusdeferens），一端接著睪丸（Testis）的曲細精管，具體結構主要包括輸出小管和附睪管。附睪緊貼睪丸的上端和后緣，可分為頭、體、尾三部。精子離開睪丸后通過輸出小管進入附睪。附睪具有暫存精液并分泌附睪液營養精子的功能，以促進精子的進一步成熟附睪的功能是暫存精子，促進精子的進一步成熟。精子在附睪內獲得運動能力，總共停留8～17天，終達到功能上的成熟。在這個過程中，精子除了自身的因素，還受到附睪微環境的影響，這包括了一系列的物理、化學變化和精子形態的改變。可以說，附睪微環境正常穩定是附睪發揮促成熟這一功能的必要條件。若附睪的功能發生異常，精子則不能成熟，引起不育。附睪上皮含有主細胞、基細胞、亮細胞等幾種類型細胞。基細胞，其頂部離附睪管腔有一定距離，在附睪各部分，其形態沒有差別，一般認為是貯備細胞；另一種主細胞，是維持附睪生理功能的物質基礎，在各區段的主細胞形態結構差別很大，這也反映出各區段的生理功能的差異。除上皮細胞外，附睪的管壁組織結構也有規律性的變化，附睪管起始段平滑肌有自發地節律性收縮，而尾部平滑肌就沒有這種特點，僅在射精一瞬間出現強烈的節律收縮。作為負責提供適合精子成熟微環境的附睪，具有活躍的分泌與吸收功能。其中，附睪上皮的電解質和水分的轉運，對保持附睪內合適的離子濃度和酸堿度，為精子成熟提供適宜的環境起著相當重要的作用。睪丸的支持細胞每天能產生大量睪網液，如一只公羊每天約能分泌40毫升睪網液，而從附睪排出的只不過幾百微升，也就是說睪丸分泌液有99%被附睪上皮重新吸收回體內。動物實驗表明，結扎輸精管時睪丸不會腫脹，但若結扎睪丸輸出小管，睪丸天就會腫脹，這就充分證實了附睪存在著強有力的吸收功能，但是重新吸收的意義尚不清楚。體外培養附睪上皮細胞對精子的發育、成熟，不孕不育，附睪生理基礎功能研究具有重要意義。

培養信息：

包被條件：鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基：含FBS、EGF、Hydrocortisone、腎上腺素、甲狀腺素、Insulin、Transferrin、Selenium Solution、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態：上皮細胞樣

傳代特性：可傳1-2代

消化液：0.25%胰蛋白酶

培養條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔附睪上皮細胞體外培養周期有限；建議使用配套的生長培養基及正確的操作方法來培養，以此保證該細胞的佳培吒?吒

方法簡介：

實驗室分離的兔附睪上皮細胞采用膠原酶消化結合差速貼壁法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測：

實驗室分離的兔附睪上皮細胞經PCK熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、、酵母和等。

公司正在出售的產品：

實驗具體步驟：

（1）動物福利：小鼠麻醉犧牲/處死，或者斷頸處死；

（2）小鼠：可以將小鼠腹部使用75%乙醇擦拭3次，或者簡單粗暴的使用75%乙醇在燒杯中浸泡3min，然后轉移至無菌操作臺使用無菌吸水紙/棉花將酒精擦拭干凈；
（3）取出心臟組織：用眼科剪在鑷子的配合下打開腹腔，取出心臟組織，置于含有2X雙抗冰冷PBS的培養皿中；
（4）組織：在含有2X雙抗PBS中將心臟一分為二，充分洗滌里邊的血液，/3次，每次5min；
（5）破碎組織：使用眼科鉗或者剪刀，將心臟組織剪碎至1-3 mm3大小組織塊；（備注：如果可以使用0.08% 胰蛋白酶和0.3 mg/ml膠原酶Ⅰ于37℃聯合消化組織3-5 min，

利于后期細胞從組織塊中爬出來，同時能夠消除部分結締組織等）

鑷子將組織塊種植于培養皿中（備注：破碎組織塊可能還含有液體，可以在一個無菌培養皿底沾幾下，把液體）；種植完成后，可以將培養皿正置3-5小時，然后更換培養皿的
蓋子正置放置過夜（也可以使用封口膜密閉培養皿在4℃正置過夜）；

（7）培養基培養：將組織塊中輕柔緩慢的加入完全培養基，然后在恒溫潮濕細胞培養箱（37℃，5% CO2）培養48h后觀察單個細胞從組織塊中爬出情況，一般3-5 day能夠達到傳代的爬出效率；

根據細胞數量種植到對應的培養皿/瓶中；